用熒光素、同位素或酶標(biāo)記抗體或抗原，用于抗原或抗體檢測(cè)是目前廣泛應(yīng)用的敏感、可靠的方法。上述三種常用的標(biāo)記物與抗原或抗體化學(xué)連接之后不改變后者的免疫特性。本方法可用于定性、定量或定位檢測(cè)。
1．免疫熒光技術(shù) 免疫熒光技術(shù)（immunofluorescence techni）是用化學(xué)方法使熒光素標(biāo)記的抗體（或抗原）與組織或細(xì)胞中的相應(yīng)抗原（或抗體）結(jié)合，進(jìn)行定性定位檢查抗原或抗體的方法。
（1）直接熒光法：把熒光抗體加到待檢的細(xì)胞懸液，細(xì)胞涂片或組織切片上進(jìn)行染色，經(jīng)抗原抗體反應(yīng)后，洗去未結(jié)合的熒光抗體，將待檢標(biāo)本在熒光顯微鏡下觀察，有熒光的部位即有相應(yīng)抗原存在，此法可用于病毒感染細(xì)胞、帶某種特異抗原的細(xì)胞（如T細(xì)胞和B細(xì)胞）或病原菌的檢查，也可用于組織中沉著的免疫復(fù)合物的檢查。本法的缺點(diǎn)是檢查多種抗原，就需分別制備相應(yīng)的多種標(biāo)記抗體。
（2）間接熒光法：可克服直接法需制備多種熒光抗體的復(fù)雜操作。將組織或細(xì)胞上的抗原直接與相應(yīng)抗體（不標(biāo)記熒光）結(jié)合，此為*抗體，再把能與*抗體特異結(jié)合的熒光標(biāo)記的抗免疫球蛋白抗體加入，此為熒光標(biāo)記的第二抗體，觀察結(jié)果與直接法相同。間接法比直接法敏感性高，如果用于檢查抗原的*抗體是人或動(dòng)物的只需制備一種抗人或動(dòng)物的免疫球蛋白熒光抗體。
免疫熒光技術(shù)在傳染病診斷上有廣泛的用途，如在細(xì)菌、病毒、螺旋體感染的疾病，檢查抗原或抗體，如查出IgM抗體，可做為近期接觸抗原的標(biāo)志，所以使用熒光標(biāo)記抗IgM可診斷近期感染。除微生物學(xué)方面的應(yīng)用外，還可利用單克隆抗體鑒定淋巴細(xì)胞的亞類。使用流式細(xì)胞儀（fluorescene-activated cell sorting,FACS），能自動(dòng)檢測(cè)細(xì)胞的大小、熒光強(qiáng)度。針對(duì)細(xì)胞表面不同抗原，可以使用兩種不同的熒光染料，如用異硫氰熒光素（FITC）發(fā)黃綠熒光，用羅丹明（TMRITC）發(fā)紅色熒光。由于熒光顏色不同標(biāo)記兩種不同的抗體，對(duì)同一細(xì)胞進(jìn)行雙標(biāo)記染色。對(duì)淋巴細(xì)胞亞類鑒定起著巨大推動(dòng)作用。應(yīng)用間接熒光法也用于自身免疫病的抗核抗體檢查。
2．放射免疫分析法 放射免疫分析法（radioimmunoassay RIA）應(yīng)用競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合的原理，應(yīng)作放射性同素標(biāo)記抗原（或抗體）與相應(yīng)抗體（或抗原）結(jié)合，通過測(cè)定抗原抗體結(jié)合物的放射活性判斷結(jié)果，本方法可進(jìn)行超微量分析，敏感性高，可用于測(cè)定抗原、抗體、抗原抗體復(fù)合物。本法常用的同位素有125Ⅰ和131Ⅰ。
放射免疫分析常用的有液相法和固相法兩種：（1）液相法：將待檢標(biāo)本（例如含胰島素抗原）與定時(shí)的同位素標(biāo)記的胰島素（抗原）和定時(shí)的抗胰島素抗體混合，經(jīng)一定作用時(shí)間后，分離收集抗原抗體復(fù)合物及游離的抗原，測(cè)定這兩部分的放射活性，計(jì)算結(jié)合率。在反應(yīng)系統(tǒng)中，待檢標(biāo)本的胰島素抗原與同位素標(biāo)記的胰島素競(jìng)爭(zhēng)奪戰(zhàn) 性與胰島素抗體結(jié)合。非標(biāo)記的抗原越多，標(biāo)記抗原與抗體形成的復(fù)合物越少。非標(biāo)記抗原含量與標(biāo)記抗原抗體復(fù)合物的量呈一定的函數(shù)關(guān)系。預(yù)先用標(biāo)準(zhǔn)的非標(biāo)記抗原作成標(biāo)準(zhǔn)曲線后，即可查出待檢標(biāo)本中胰島素的含量（2）固相法：將抗原或抗體吸附到固相載體表面，然后加待檢標(biāo)本，zui后加標(biāo)記抗體。測(cè)定固相載體的放射活性，常用的固相載體有溴化氰（CNBr）海豹化的紙片或聚苯乙烯小管。放射免疫分析法應(yīng)用范圍廣泛，包括多種激素（胰島素、生長(zhǎng)激素、甲狀腺素等）維生素、藥物、IgE等。
3．酶聯(lián)免疫分析法 酶聯(lián)免疫分析法（enzyme immunoassay,EIA）是當(dāng)前應(yīng)用zui廣泛的免疫檢測(cè)方法。本法將抗原抗體反應(yīng)的特異性與酶對(duì)底物催化作用結(jié)合起來，根據(jù)酶作用底物后顯色，以顏色變化判斷試驗(yàn)結(jié)果，可經(jīng)酶標(biāo)測(cè)定儀作定量分析，敏感度可達(dá)ng水平。常用于標(biāo)記的酶有辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase）、堿性磷酶（alkaline phosphatase）等。它們與抗體結(jié)合不影響抗體活性。這些酶具有一定的穩(wěn)定性，制成酶標(biāo)抗體可保存較長(zhǎng)時(shí)間。目前常用的方法有酶標(biāo)免疫組化法和酶聯(lián)免疫吸附法。前者測(cè)定細(xì)胞表面抗原或組織內(nèi)的抗原；后者主要測(cè)定可溶性抗原或抗體。本法既沒有放射性污染又不需昂貴的測(cè)試儀器，所以較放射免疫分析法更易推廣。
（1）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）:是與上述固相RIA相似的原理，將抗原或抗體吸附在固相載體表面。使抗原抗體反應(yīng)在固相載體表面進(jìn)行政區(qū)。可用間接法、雙抗體夾心法或競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)定抗原或抗體。
（2）夾心法（sandwich assay）:將已知的特異抗體包裝在固相載體（塑料板凹孔或紙片上），加入待檢標(biāo)本，標(biāo)本中的抗原即可與載體上的抗原結(jié)合，洗去未結(jié)合的材料后加入該抗原的酶標(biāo)記抗體，洗去未結(jié)合的酶標(biāo)抗體，加底物顯色，用酶免疫檢測(cè)儀測(cè)量顏色的光密度，可定量測(cè)定抗原。
間接法（indirecr ELISA）常用于檢查特異抗體。先將已知特異抗原包被固相載體，加入待檢標(biāo)本（可能含有相應(yīng)抗體），再加入酶標(biāo)抗Ig的抗全（即第二抗體），經(jīng)加底物顯色后，根據(jù)顏色的光密度計(jì)算出標(biāo)本中抗體的含量。
（3）BAS-ELISA：近年來對(duì)酶免設(shè)分析法的改進(jìn)是使用生物素-親合素-過氧化物酶復(fù)合物作為指示劑，組成一新的生物放大系統(tǒng)進(jìn)一步提高檢測(cè)的敏感度。可用來檢測(cè)多種抗原抗體系統(tǒng)如細(xì)菌、病毒、腫瘤細(xì)胞表面抗原等。一個(gè)親合素（avidin）分子可以結(jié)合4個(gè)生物素分子（biotin）。結(jié)合非常穩(wěn)定。親合素和生物素都可與抗全、酶、熒光素等分子結(jié)合，而不影響后者的生物活性。一個(gè)抗體分子可偶聯(lián)90個(gè)生物素分子，通過生物素又可連接多個(gè)親合素。因此大提高檢測(cè)的敏感度。目前應(yīng)用生物-酶標(biāo)親合素系統(tǒng)（biotinavidin system- ELISA,BAS-ELISA），它是通過生物素標(biāo)記抗體連接免疫反應(yīng)系統(tǒng)，同時(shí)借助生物素化酶或酶標(biāo)親合素引入酶與底物反應(yīng)系統(tǒng)。
表 1 免疫學(xué)測(cè)定方法敏感性比較
測(cè)定方法
敏感性（每升）
單向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)
＜1～2mg
雙向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)
＜1mg
火箭電泳
＜0.5mg
對(duì)流電泳
＜0.1mg
免疫電泳
＜5～10mg
凝集試驗(yàn)
1μg
被動(dòng)血凝試驗(yàn)
1μg
血凝抑制試驗(yàn)
0.1μg
補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)
0.1μg
放射免疫分析法
＜1pg
酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)
＜1ng
定量免疫熒光分析
＜1pg
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